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肝癌组织中Raf激酶抑制蛋白和磷酸化Raf激酶抑制蛋白的表达及其意

期刊级别: 综合论文写作指导
【摘要】 目的 探讨Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)和磷酸化Raf激酶抑制蛋白(Phosphorylated raf kinase inhibitor protein,P²RKIP)在肝细胞癌中的表达及其临床意义。方法 应用组织芯片和免疫组织化学方法检测RKIP蛋白和磷酸化的RKIP蛋白在72例肝细胞癌组织、50例癌旁肝组织及16例正常肝组织中的表达,并分析RKIP的表达与肝细胞癌临床病理学特征的关系。采用Western blot方法检测36例肝细胞癌、36例癌旁组织及12例正常肝组织中RKIP蛋白和磷酸化的RKIP蛋白的表达。结果 免疫组化结果显示肝细胞癌、癌旁及正常肝组织中RKIP的阳性率分别为22.2%、86%、93.8%,P²RKIP为29.2%、84%、93.8%;肝癌组织中RKIP和P²RKIP的表达显著低于癌旁及正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05),而且肝癌组织和癌旁肝组织中两者蛋白的表达均呈显著正相关(P=0.000,P=0.005);RKIP和P²RKIP的表达均与肝癌有无肝内或淋巴结转移及分化程度有关(P<0.05)。Western blot结果显示肝癌组织中RKIP和P²RKIP的表达显著低于癌旁及正常肝组织。结论 RKIP和 P²RKIP表达的减少或缺失与肝癌的发生发展、侵袭转移密切相关。
【关键词】 肝细胞癌 Raf激酶抑制蛋白 转移
0 引言

  Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine.binding protein,PEBP)家族,PEBPs是一类21~23kDa的进化高度保守的蛋白家族,广泛存在于各种生物中[1]。RKIP参与了多条信号传导通路的调控,在细胞生长、增殖、分化、凋亡以及肿瘤转移等过程中发挥重要作用[2]。我们运用免疫组织化学法检测肝细胞肝癌、癌旁及正常肝组织中RKIP和P²RKIP的表达,探讨RKIP和P²RKIP与肝细胞癌的关系。
  1 资料与方法
  1.1 一般资料

  72例肝癌和50例癌旁标本来自我院2003年1月~2007年3月手术切除并经病理证实的肝细胞肝癌患者,癌旁组织为距肿瘤2cm处肝组织。另取手术治疗的良性疾病正常肝组织16例作对照。标本10%的福尔马林固定。肝癌组男59例,女13例;年龄30~76岁,平均53.6岁;病理学分级根据Edmondson分级法,其中Ⅰ、Ⅱ级30例,Ⅲ、Ⅳ级42例。
  1.2 主要试剂

  山羊抗人RKIP多抗,兔抗人P²RKIP多克隆抗体和鼠抗人β²actin单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。即用型两步法免疫组化试剂盒、通用型SP试剂盒、浓缩型DAB试剂盒,均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
  1.3 组织芯片的制备

  石蜡包埋的组织5μm厚切片,常规HE染色,由有经验的病理医师诊断核实,标记取材部位;用直径0.6mm的打孔针从供体蜡块的选定部位逐个取出组织芯,利用ZM²1组织芯片仪制成组织芯片蜡块(图略)。
  1.4 免疫组织化学法检测

  将组织芯片蜡块4μm厚切片,采用常规二甲苯脱蜡,梯度酒精水化;行柠檬酸高压锅内修复抗原5min;3%甲醇过氧化氢灭活内源性过氧化物酶15min;山羊抗人RKIP多抗和兔抗人P²RKIP多克隆抗体(1∶100)分别行免疫组化二步法和SP方法检测(具体操作按照说明书进行)。同时设阳性和阴性对照:阳性对照为试剂公司提供的强阳性标本切片,阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)代替一抗。
  1.5 免疫组化结果判断

  RKIP和P²RKIP蛋白表达强度根据阳性物质的着色深浅及面积判断。评分标准按Shimizu方法,对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记0、1、2、3分,着色阳性面积按无着色、着色<1/3、1/3~2/3、>2/3分别记0、1、2、3分,然后根据两项记分之和判断其结果:≥3分为阳性。
  1.6 Western blot方法检测不同肝组织中RKIP和P²RKIP蛋白的表达

  储存标本从-80℃冰箱中取出,倾去冻存液,在电子秤上称重。按每200mg组织加1000μl蛋白裂解液,在冰浴条件下加入裂解液,置匀浆器中反复研磨,使组织充分匀浆化。冰浴60min后,低温离心4℃、12000r/min离心15min。小心吸取上清即为组织蛋白。36例肝癌及对应的癌旁组织、12例正常肝组织成功提取总蛋白。考马斯亮蓝测定总蛋白浓度,取100μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,PVDF膜电转移,5%脱脂奶粉溶液封闭非特异性抗原,加入1∶500稀释的RKIP和P²RKIP多抗, 4℃过夜,漂洗后加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,常温作用2h,洗膜后ECL化学发光法观察结果。结果扫描后在凝胶成像仪上进行光密度值分析,RKIP和P²RKIP(23KD)与β²actin(42KD)比值作为RKIP和P²RKIP蛋白表达水平的参数,对RKIP和P²RKIP产物相对定量。
  1.7 统计学方法

  所有数据均应用SPSS.10.0统计软件进行分析。RKIP和P²RKIP蛋白表达水平的组间显著性差异计数资料采用卡方检验,计量资料采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 不同肝组织RKIP和P²RKIP的免疫组织化学染色结果

  RKIP阳性着色主要分布于细胞浆,小部分胞膜中也有表达;P²RKIP阳性着色主要定位在胞浆。RKIP和P²RKIP在肝癌组织中的表达水平均低于癌旁及正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05),见表1,图2、3。RKIP和P²RKIP蛋白表达水平与HCC组织分化程度、肝内或淋巴转移呈负相关(P<0.05),均与肿瘤大小、AFP水平及有无门静脉或胆管癌栓无关(P>0.05),见表2。肝癌组织中RKIP和P²RKIP的表达呈显著正相关(P=0.000),见表3。癌旁肝组织中RKIP和P²RKIP的表达呈显著正相关(P=0.005),见表4。
  2a:Positive expression of RKIP in normal liver tissue;2b:Positive expression of RKIP in Paracarcinoma;2c:Negative expression of the human RKIP protein in HCC;3a:Positive expression of P²RKIP in Paracarcinoma;3b:Negative expression of the human P²RKIP protein in HCC
  图2 RKIP在不同肝组织中的表达(IHC×400) (略)
  图3 P²RKIP在不同肝组织中的表达(IHC×400)(略)
  Fig 2 Expression of RKIP in different liver tissue(IHC×400)
  Fig 3 Expression of P²RKIP in different liver tissue(IHC×400)
  表1 RKIP和P²RKIP在不同肝组织中的表达(略)
  Tab 1 Expression of RKIP and P²RKIP in HCC, Peritumoral tissues and normal liver tissues
  *:compared with HCC, P<0.05
  表2 肝癌组织中RKIP和P²RKIP的表达及其与肝癌临床病理特征的关系(略)
  Tab 2 Correlation between the expression of RKIP and P²RKIP with the clinicopathological characteristics of HCC
  2.2 Western blot结果

  Western blot结果显示RKIP和P²RKIP在肝癌组织中的表达水平均显著低于癌旁及正常肝组织(P<0.05),但在癌旁和正常肝组织之间RKIP和P²RKIP的表达差异无统计学意义(P>0.05),见表5、图4。
  表3 肝癌组织中RKIP和P²RKIP表达的关系(略)
  Tab 3 Relationship between expression of RKIP and P²RKIP in HCCs
  表4 癌旁肝组织中RKIP和P²RKIP表达的关系(略)
  Tab 4 Relationship between expression of RKIP and P²RKIP in Peritumoral tissues of HCC
  表5 不同肝组织中RKIP和P²RKIP的Western blot结果(略)
  P:compared with HCC
  图4 不同肝组织中RKIP和P²RKIP表达的Western blot结果(略)
  Fig 4 Expression of RKIP and P²RKIP protein in different liver tissues were detected by Western blot
  3 讨论

  肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,易复发、转移且预后差。目前肝细胞癌的治疗方案日趋完善,但疗效差,术后5年生存率仅20%左右。控制肝癌侵袭转移已经成为肝癌治疗很重要的一部分。

  最近研究表明RKIP具有抑制恶性黑色素瘤[3]、乳腺癌[4]、结肠直肠癌[5]、肝癌[6]等多种恶性肿瘤转移的作用,被认为是肿瘤转移抑制基因。Fu等[7]首先研究发现,与非转移性前列腺癌细胞系相比,转移性前列腺癌细胞系RKIP mRNA和蛋白明显下调,RKIP表达的减少或缺失增加了前列腺癌细胞的侵袭性及血管的新生,从而揭示出RKIP通过减少血管生成和脉管入侵抑制肿瘤细胞转移。Keller[8]研究发现在转移的前列腺癌细胞系中,RKIP在mRNA水平和蛋白水平均低于非转移的前列腺癌细胞,在转移的肿瘤组织中常检测不到RKIP的表达。在乳腺癌和黑色素瘤中也发现RKIP功能的丧失能增加转化细胞的浸润能力,从而促进转移的发生[4,9]。最近Fu研究表明血中RKIP的表达水平可作为评估前列腺癌预后的指标[10] 。RKIP表达的缺失可通过诱导趋化因子受体的表达促进乳腺癌细胞的侵袭转移[11],同时能增加细胞的遗传不稳定性[12]和肝癌细胞的侵袭性[6]。以上研究表明RKIP表达的缺失与肿瘤细胞生长和扩散的多个环节相关。

  我们的研究结果显示肝癌组织中RKIP表达减少,而且RKIP蛋白表达水平与HCC组织分化程度呈负相关;在肝内或淋巴转移组RKIP表达明显下调(P<0.05),但RKIP蛋白表达与有无门静脉或胆管癌栓无关。以上说明RKIP表达减少或缺失与肝癌细胞分化及肝癌的侵袭转移有关,在肝癌的发展及侵袭转移过程中起重要作用。但Hagan等[4]研究认为RKIP的表达与抑制乳腺癌转移有关,但与乳腺癌分化程度无关。研究结果的差异可能与组织类型不同有关。

  RKIP存在能被蛋白激酶C(PKC)磷酸化的位点丝氨酸153, PKC激活后,使RKIP磷酸化并从Raf²1上解离,从而提高ERK通路的活性;同时磷酸化的RKIP与G蛋白偶联受体激酶²2(G Protein²coupled receptor kinase 2,GRK²2)结合,导致G蛋白信号通路的活化, RKIP介导的这种全新的交叉调节机制,有助于维持Raf²1的促进生长信号和GRK²2抑制生长信号的动态平衡[13]。Eves 研究发现P²RKIP定位于染色体的中心体和有丝分裂的着丝点部位,对细胞周期检测点蛋白和细胞周期具有调节作用[12]。以上说明RKIP的磷酸化活性将Raf²1/MEK/ERK和G蛋白偶联受体两条重要的细胞信号调节通路连接在一起,并且在细胞周期进程中发挥重要作用。但RKIP的磷酸化水平与恶性肿瘤之间的关系未见报道。我们的研究结果显示磷酸化的RKIP在肝癌组织中表达明显低于癌旁及正常肝组织,且P²RKIP蛋白表达水平与HCC组织分化程度、肝内或淋巴转移有关(P<0.05),说明P²RKIP蛋白表达水平的减少或缺失与肝细胞癌侵袭转移的生物学行为有关。我们的研究结果显示肝癌组织和癌旁肝组织中P²RKIP和RKIP的表达具有相关性(P=0.000,P=0.0008),说明RKIP和P²RKIP在抑制肝癌的发生发展、侵袭转移过程中共同发挥重要作用,其具体机制有待进一步研究。

  总之,肝细胞癌侵袭转移与RKIP和P²RKIP蛋白表达水平减少或缺失有关,RKIP有望成为肝癌治疗尤其是抑制肝癌侵袭转移的新的有价值的靶点。
【参考文献】
 
 
肝癌组织中Raf激酶抑制蛋白和磷酸化Raf激酶抑制蛋白的表达及其意
肝癌组织中Raf激酶抑制蛋白和磷酸化Raf激酶抑制蛋白的表达及其意
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