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端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验

期刊级别: 综合论文写作指导
【摘要】 目的 研究端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞株的凋亡诱导作用及其机制。方法 以人肝癌细胞株SMMC²7721、正常肝细胞株L²02为研究对象,采用TRAP²ELISA法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析;细胞形态学、TUNEL染色、DNA 琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用,用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析,Western杂交对细胞周期蛋白进行研究。结果 一定浓度的端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性,肝癌细胞端粒酶活性被抑制后传代23~26次出现细胞凋亡。细胞凋亡与细胞周期蛋白有关。结论 端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性并诱导其凋亡。
【关键词】 端粒酶 肝癌 反义寡核苷酸 细胞凋亡
0 引言

  我国为肝癌高发国家,据统计肝癌位居男性肿瘤患者死亡原因的第二位[1]。肝癌的发生发展与端粒酶激活密切相关。端粒酶由三部分组成,即端粒酶RNA、端粒酶逆转录酶和端粒酶相关蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色体末端端粒序列时必须以自身的RNA为模板[2]。端粒酶RNA由450 个核苷酸组成,其中11个核苷酸为端粒合成的模板序列。我们设想,封闭端粒酶RNA的模板序列,干扰端粒酶向染色体末端添加端粒序列的过程, 使癌细胞端粒长度的稳定机制破坏,就可使永生化细胞的癌细胞无限增殖受限,从根本上抑制肿瘤细胞生长。本实验目的在于观察靶向端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸对肝癌细胞端粒酶活性及肿瘤细胞生长的影响,为肝癌治疗探索一条新的、有效的途径。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  1.1.1 细胞株 肝癌细胞株SMMC²7721,正常肝细胞株L²02,购自中科院上海细胞生物技术研究所。
  1.1.2 TRAP反应试剂、TUNEL检测试剂、Western单抗为宝灵曼公司产品。
  1.1.3 聚丙烯酰胺银染试剂 硝酸银(AgNO3),无水碳酸钠(Na2CO3),购自华美生物公司。
  1.1.4 仪器 Beckman CS²15R低温离心机,Perkin²Elmer gene PCR仪,MK²2酶标仪。
  1.2 方法
  1.2.1 端粒酶反义DNA的设计 选择近端粒酶 RNA 模板区的20个核苷酸为反义靶位,设计合成端粒酶反义 DNA 序列、正义序列、随机序列,见表1。硫代反义DNA由中科院上海细胞所合成与纯化,纯度达98%以上。
  表1 端粒酶模板区反义、正义及随机序列(略)
  Tab 1 The sequence of sense, anti²sense and control²scrabled
  1.2.2 TRAP²PCR²ELISA检测肿瘤细胞端粒酶活性[3]。
  1.2.3 合成DNA对肝癌细胞端粒酶活性的影响 1×106 SMMC²7721培养于Nunclon 24 孔板,培养液1ml含10% 热灭活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素,培养条件为37℃、5% CO2 。正义、随机、反义DNA终浓度为10μmol/L,以PBS为对照,作用时间分别为12、24、36、48、60h,培养结束后胰酶消化,PBS洗2次,TRAP²ELISA法定量测定端粒酶活性,每一DNA设3复孔。进一步观察倍比稀释后的端粒酶反义DNA(浓度为10、5、2.5、1.25μmol/L)作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。
  1.2.4 凋亡研究

  (1)TUNEL染色观察细胞染色及细胞调亡 4×105/ml培养细胞种植于12孔细胞培养板,不同寡核苷酸作用14天后PBS洗涤2次进行细胞爬片,按TUNEL试剂盒说明对细胞进行固定、通透、标记反应,苏木素染色,封片,拍照。

  (2)流式细胞仪细胞周期分析 1×104细胞经5μmol/L反义DNA作用14天的细胞进行细胞周期时相分析。

  (3)DNA抽提及电泳 将1×106经反义DNA作用14天的细胞移入1.5ml离心管,加裂解液及蛋白酶²k,55℃水浴20min,加RNA酶 10μl 作用2min,酚、氯仿²异戊醇各抽提1次,加3M乙酸钠、无水乙醇沉淀DNA,3000g离心10min,气干,TE溶解沉淀。 取抽提好的DNA 5μl,在1.8%琼脂糖凝胶、5V/cm电压下,电泳3h,以Hind² Ⅲ酶切的λDNA为分子标志,302nm紫外光透照并照相。
  1.2.5 Western分析细胞周期相关蛋白 收集经反义DNA作用14天的SMMC²7721肝癌细胞(以未作任何处理的SMMC²7721阴性对照),裂解液裂解,蛋白产物进行SDS²PAGE电泳(15%浓缩胶,5%分离胶),电泳产物半干电转移至NC膜上(转移时间p21为45min,CyclinD1、Cdk2为1h),50g/L脱脂奶粉室温封闭4h,TBS漂洗3次,分别加入抗小鼠CyclinD1,抗兔Cdk2、p21单克隆抗体及作为内参照的β²actin单克隆抗体,4℃过夜反应,TBS漂洗3次,再加入相应二抗,室温反应4h,TBS漂洗3次后,DAB显色。
  1.3 统计学方法

  方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 合成反义、正义、随机序列DNA作用不同时间对肝癌细胞株SMMC²7721端粒酶活性的影响

  10μmol/L合成端粒酶反义DNA对肝癌细胞端粒酶活性具有显著抑制作用,这种抑制作用开始于12h,60h端粒酶活性被完全抑制,而正义链及随机链对细胞端粒酶活性无显著影响,见表2、图1。
  表2 合成DNA对SMMC²7721细胞端粒酶活性的影响(1×10 6/ml) (略)
  Tab 2 The effection of Synthesised DNA on telomerase activity(1×10 6/ml)
  *:The difference is significant compared to the control,P<0.01
  a:Control scrambled;b:Sense;c: Anti²sense
  图1 端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性的抑制作用(略)
  Fig 1 The inhibitory effect of anti²sense telomerase oligonucleotide for telomerase activity
  2.2 反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用
  2.2.1 TUNEL标记 在倒置显微镜下我们观察反义寡核苷酸作用14天的细胞,发现60%的癌细胞被染成棕色,并有凋亡小体的产生,凋亡细胞数显著高于正义序列,见图2。
  a: Anti²sense light microscope(×800);b: Sense light microscope(×400)
  图2 端粒酶反义及正义寡核苷酸作用14天TUNEL染色(略)
  Fig 2 TUNEL staining for SMMC²7721 after anti²sense and sense telomerase oligonucleotide affected for 14 days
  2.2.2 DNA电泳 反义寡核苷酸作用14天,光镜下癌细胞呈凋亡改变,DNA抽提电泳出现凋亡条带,见图3。
  a:Genomic;b,c:Anti²sense;d:Sense
  图3 端粒酶反义寡核苷酸作用14天细胞DNA电泳图(略)
  Fig 3 The DNA electrophoresis after anti²sense telomerase oligonucleotide affected for 14 days
  2.2.3 端粒酶活性与细胞周期的关系 合成DNA与1×104/ml细胞共育2周,反义DNA在端粒酶活性被抑制后,S期细胞百分数下降,而G2/M期细胞百分数增高,细胞聚集于G2/M期,见表3。
  表3 端粒酶DNA对细胞周期的影响(n=3)(略)
  Tab 3 The effection of telomerase DNA on the cell cycle(n=3)
  *:The difference is significant compared to the control,P<0.012.3 细胞周期调控因子检测结果

  反义寡核苷酸作用的肝癌细胞培养14天后收集裂解细胞总蛋白,以β²actin作内对照,Western blot技术检测CyclinD1(细胞周期素)、Cdk2(细胞周期素依赖性蛋白激酶)和p21(细胞周期素依赖性激酶抑制因子)的表达,结果显示在β²actin等量的情况下,与正义序列比较反义寡核苷酸作用的肝癌细胞CyclinD1、Cdk2的表达下降而p21蛋白的表达显著增加,见图4。
  图4 端粒酶反义DNA作用后SMMC²7721细胞周期相关蛋白的表达(略)
  Fig 4 The expression of cell Cyclin after telomerase²antisense DNA affected
  3 讨论

  我国为病毒性肝炎高发国家,病毒性肝炎相关肝硬化、肝癌的发生率居高不下。病毒感染可造成肝细胞变性坏死、假小叶形成。肝细胞在不断坏死及增殖过程中与病毒核酸整合而造成肝细胞端粒酶激活、无限增殖、永生化而恶变。因此,端粒酶激活在肝细胞癌变及其恶性增殖中起决定性作用[4]。端粒酶是核糖核蛋白复合体,主要功能是向分裂细胞染色体末端添加端粒重复序列以保证肿瘤细胞的无限增殖。

  肿瘤细胞因端粒酶激活而恶性增殖,因此,用反义核酸来抑制或消除肿瘤细胞端粒酶活性成为近年肿瘤治疗研究的热点,核酸类药物抗肿瘤具有广泛临床应用前景[5]。研究指出:在寡脱氧核苷酸上通过共价连接引入一定的活性基团,可使该寡核苷酸耦合物除具有一般寡核苷酸特性外,其耐核酸酶能力、与靶核酸分子结合的强度及细胞对寡核苷酸摄取等均显著增强[6], 修饰的寡核苷酸被认为是选择性抑制基因表达的新工具和抗肿瘤治疗最有前途的新药。我们对靶向端粒酶模板区的反义DNA的研究发现:反义DNA能识别并与端粒酶模板RNA结合而抑制肝癌细胞端粒酶活性,端粒酶活性的下降具有浓度依赖性,10μmol/L的反义DNA作用12h即开始产生抑制作用,继续作用60h端粒酶活性几乎完全被抑制,实验中反义DNA作用的时间延搁为12h,可能与其进入细胞的过程有关[7]。

  随着肝癌细胞端粒酶活性的被抑制,肿瘤细胞出现生长阻滞,因此,端粒酶反义DNA抑制肿瘤细胞增殖是通过抑制其端粒酶活性实现的。肝癌细胞端粒酶活性的抑制,意味着癌细胞失去了赖以永生化的物质基础而转为“非永生化”。

  凋亡研究结果显示:端粒酶失活的癌细胞继续培养,细胞活力显著下降并出现调亡。端粒酶反义DNA与肝癌细胞共育14天后,TUNEL染色60%的癌细胞被染成棕色,形态学上表现核深染、染色质边集、核碎裂及凋亡小体形成;细胞DNA电泳呈凋亡特征性Ladder,流式细胞仪研究显示S期细胞的百分数显著下降,说明发生凋亡的细胞为处于细胞周期S期的细胞[8]。

  Western杂交结果显示反义DNA作用的肝癌细胞Cdk2、CyclinD1的表达量下调而p21表达增加。这就意味着端粒酶反义DNA通过对端粒酶活性的抑制而影响了细胞p21的表达。有研究表明细胞周期监控机制的破坏可导致细胞基因组不稳定和基因突变,肿瘤细胞CyclinD1的过度表达可缩短肿瘤细胞G1期使细胞持续生长,而p21的高表达则抑制肿瘤增殖并促进其发生分化[9], p21能与Cdk2结合形成稳定的复合物,阻止其与CyclinD1的结合。我们所合成的端粒酶反义DNA有可能通过细胞周期因子CyclinD1、Cdk2和p21的调控来抑制肝癌细胞的增殖。

  端粒酶反义DNA分子特异地与细胞内端粒酶RNA结合,但对染色体端粒酶基因并无封闭作用,因此,反义DNA对端粒酶活性的抑制是可逆的。我们将去除反义分子的细胞继续培养20天,端粒酶弱表达且不能恢复到原来的水平,发生这种现象的原因可能与下列因素有关:(1)进入细胞内的反义DNA有足够量结合新转录的端粒酶RNA模板序列;(2)端粒酶发挥作用必须以全酶的形式,端粒酶蛋白质成分在端粒酶活性调控中起主要作用,反义分子与端粒酶 RNA 结合后可影响其蛋白质亚单位的构象或功能而影响端粒酶活性,即使细胞端粒酶RNA基因有转录,其蛋白质成分也不能发挥作用;(3)端粒酶在细胞内被灭活后, 肿瘤细胞自身也发生了一系列的变化,如分化、老化及凋亡,端粒酶活性均显著降低[10]。

  总之,我们的研究表明,端粒酶反义DNA能抑制肝癌细胞端粒酶活性,并通过此途径抑制肝癌细胞增殖、使S期细胞凋亡。靶向端粒酶的核酸类药物有潜在临床应用前景,值得进一步研究。
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