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DC-CIK细胞治疗对晚期卵巢癌患者外周血CK19-mRNA表达的影响

期刊级别: 综合论文写作指导
【摘要】 目的:探讨DC-CIK细胞联合化疗对卵巢癌患者外周血CK19-mRNA表达的影响。方法:将37例外周血CK19表达阳性的中晚期卵巢癌患者随机分为两组,实验组25例采用PC方案+DC-CIK进行治疗,对照组12例采用PC方案进行治疗,采用相对定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测治疗前及3个周期后两组患者CK19-mRNA表达的水平,并观察患者的疗效及生存期。结果:经3个周期治疗后,实验组、对照组CK19-mRNA相对表达量均下降,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,实验组下降更明显(P<0.05)。实验组有效率(72.0%)明显高于对照组(33.3%)(P<0.05),中位生存期(11个月)明显长于对照组(7个月)(χ2=4.36,P=0.032 8)。两组Ⅲ+Ⅳ度白细胞减少率的比较差异有统计学意义(P<0.05),其余Ⅲ+Ⅳ度毒副反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:DC-CIK细胞可有效清除卵巢癌患者的微残留灶,使外周血CK19-mRNA表达量下降,起到化疗增效的作用。
【关键词】 树突状细胞;CIK细胞;卵巢癌;CK19-mRNA
  [ABSTRACT] Objective: To investigate the effect of DC-CIK combined with chemotherapy on mRNA expression of CK19 in peripheral blood of ovarian cancer. Methods:Thirty seven patients with advanced ovarian cancer were randomly divided into the study group(n=25,treated with DC-CIK combined with chemotherapy) and the control group(n=12,treated with chemotherapy). CK-19 mRNA level in peripheral blood of advanced ovarian cancer patients was determined after 2 cycles by relative quantity RT-PCR. The efficacy and overall survival of each group were observed. Results: The level of CK-19 mRNA of two groups was significantly decreased(P<0.05), as compared with that before chemotherapy. The study group reduced the level of CK-19 mRNA more effective than the control group(P<0.05). Total efficacy of study group (70.2%) was significantly higher than that of control group (33.3%)(P<0.05). Median survival time was significantly longer in study group (11 months) than that of control group(7 months)(χ2=4.36,P=0.0328). There was significant difference in rate of hypolekocytosis at Ⅲ+Ⅳ degree between two groups (P<0.05). And there was no significant difference in the incidence of other side effects at Ⅲ+Ⅳ degree between two groups (P>0.05). Conclusions: DC-CIK can enhance the therapeutic effect probably by reducing the level of CK-19 mRNA.
  [KEY WORDS] DC; CIK; Ovarian cancer; CK19-mRNA
  肿瘤是由于机体的免疫功能不足以战胜各种致病因素而造成的,其发生、发展与宿主的免疫状态有着密切的关系。传统的肿瘤治疗手段,包括手术、化疗与放疗,不但存在肿瘤迁移与复发的危险,而且具有严重的损伤正常组织和免疫功能的副作用。而新型的肿瘤细胞免疫治疗通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和免疫杀伤功能,可以清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞,达到预防肿瘤复发、转移及根治肿瘤的目的,并且具有特异性强、毒副作用小等特点。因此,肿瘤的细胞免疫治疗已经成为当今肿瘤治疗研究的热点,同时也是临床上重要的医疗手段。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine- induced killer, CIK) 是一种新型免疫活性细胞,兼有T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点,杀伤活性可达84.7% [1]。树突状细胞(dendritic cell,DC) 是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞,可有效激发T细胞应答,有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制[2]。DC与CIK 是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别病原,激活获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞,二者联合确保了一个高效和谐的免疫反应的完成。本研究通过观察卵巢癌患者DC-CIK细胞治疗前、后外周血CK19 -mRNA的表达及患者的生存期,评价DC-CIK细胞治疗恶性肿瘤的疗效。
  1 材料与方法
  1.1 病例选择
  选择2008年3月~2011年10月海南医学院附属医院血液肿瘤内科及妇科收治的晚期卵巢癌患者37例,平均年龄(56.6±4.5)岁,所有患者经病理诊断为Ⅲ/Ⅳ期,外周血CK19-mRNA表达阳性,患者预期生存大于6个月,重要生命器官功能正常,无严重病毒、细菌感染,非妊娠及哺乳期,无生物制品过敏史。
  1.2 一般资料
  将符合上述标准的37例患者随机分为两组,其中实验组25例,年龄36~75岁,中位年龄61岁;病理分期(FIGO国际妇产科联盟,2010):ⅢA期7例,ⅢB期9例,ⅢC期5例,Ⅳ期4例;病理类型(WHO,1973):浆液性囊腺癌12例,黏液性囊腺癌5例,子宫内膜样囊腺癌2例,透明细胞癌4例,混合性上皮癌2例。对照组12例,年龄35~73岁,中位年龄60岁;病理分期:ⅢA期3例,ⅢB期4例,ⅢC期3例,Ⅳ期2例;病理类型:浆液性囊腺癌6例,黏液性囊腺癌2例,透明细胞癌2例,混合性上皮癌2例。两组患者在性别、年龄、病理类型等方面经统计学处理差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
  1.3 主要试剂
  Ficoll分离液(上海华精生物);AIMV无血清培养基,重组人γ-干扰素,anti-CD3单抗,重组人白介素-2、4(IL-2、IL-4),重组人粒单集落刺激因子(GM-CSF),肿瘤坏死因子a(TNF-a)均由美国invitrogen提供;RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI公司);TRI REAGENT(MRC公司);Taq DNA聚合酶(上海生工生物技术服务有限公司);DNA Marker(北京赛百盛生物);琼脂糖(西班牙Biowest公司);氯仿、异丙醇、无水乙醇、水合氯醛(上海化学试剂公司,分析纯级)。
  1.4 DC-CIK细胞的培养
  实验组在终止化疗15 d后,无菌操作条件下,抽取患者外周血25 mL,按密度梯度离心法分离出单个核细胞,在体外分别诱导培养成DC、CIK细胞。DC培养体系:重组人粒单集落刺激因子100 g/L、IL-4 500 U/mL、TNF-a 10 g/L,诱导培养时间为10 d。CIK培养体系:分离患者外周血单个核细胞,以AIMV培养液调整细胞浓度至1×106/mL,第1天加入γ-干扰素 1 000 U/mL、IL-2 300 U/mL,第2天加入抗CD3单克隆抗体100 μg/L,IL-2 300 U/mL,每2天半量换液。在CIK培养到第5天时,加入上述培养的DC细胞,进行共同培养,获取DC-CIK细胞。上述体外细胞分离、培养扩增过程均在符合GMP标准的实验中进行,扩增培养时间为10~11 d。
  1.5 治疗方法
  PC方案:卡铂(伯你定)AUC=7.5 i.v. d,泰素 175 mg/m2 i.v.(3 h输注) d,3周为1个周期。实验组在终止化疗后15 d 采用DC-CIK细胞静脉输注,每次输注细胞数≥109,每个疗程>5 ×109,每2天输注1次,5次为1个疗程,每疗程间隔10 d,每例均3个疗程。
  1.6 CK19-mRNA基因表达的测定
  3个周期化疗前、后分别采取各组患者外周血(肝素抗凝)5 mL,进行有核细胞分离提取总RNA,按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。PCR引物:根据人CK19 mRNA、GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, mRNA) mRNA(内参),采用引物设计软件Primer Premier 5.0 设计。CK19 mRNA(NM_0022761)上游:5′- AGGAGATTGCCACCTACCG-3′(1266-1285),下游:5′ –CCTTCCCATCCCTCTAC CC-3′(1410-1391),145 bp;GAPDHmRNA(NM_014364)上游:5′- GCACCTCGG TAACATCACA-3′(63-82),下游:5′ –CACCACCTTAACACCCTTCT- 3′ (422-402),360 bp。所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成。然后在Mastercycler gradient PCR仪(德国Eppendorf 公司)上,按照下列热循环参数进行PCR。12 μL PCR产物(含CK19,GAPDH的PCR产物各5 μL及2 μL 6×loading buffer)于1.5%的琼脂糖(含EB),在80V稳压电源下电泳1.5~2 h(4V/cm)。结果在紫外灯下摄影保存。用SYNGENE凝胶成像系统(英国Syngene公司)扫描条带灰度值,并以GAPDH灰度值作为参考定量标准,求得待测基因/GAPDH的比值作为待测基因mRNA的相对表达量。
  1.7 疗效评定
  采用WHO 通用标准:完全缓解(CR),可测量的病灶完全消失,维持4周以上;部分缓解(PR),可测量的病灶最大直径及最大垂直横径的乘积缩小一半及以上,无新病灶出现;好转(MR),可测量的病灶两径乘积缩小25 %~50 %,无新病灶出现;稳定( SD),可测量的病灶两径乘积缩小< 25 %或增大< 25 %,无新病灶出现;进展(PD),可测量的病灶两径乘积增大> 25 %,或出现新的病灶。有效率= [(CR + PR) /治疗病人总数]×100 %。
  1.8 统计学处理
  数据以SPSS10.0统计软件进行统计处理。计量资料的比较采用配对及成组t检验,有效率及毒副反应发生率的比较采用卡方检验。用Kaplan-Meier进行生存分析,Log-Rank检验分析两组生存差异。P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 两组治疗前、后CK19-mRNA相对表达量的比较
  经3个周期治疗后,实验组、对照组CK19-mRNA相对表达量均下降,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,实验组下降更明显(P<0.05)。见表1。表1 两组治疗前、后CK19-mRNA相对表达量的比较
  2.2 两组疗效比较
  实验组25例,CR 7例,PR 11例,SD 5例,PD 2例,有效率(CR + PR)72.0%。对照组12例,CR 2例,PR 2例,SD 5例,PD 3例,有效率(CR + PR)33.3%。两组有效率比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.3 毒副反应
  两组毒副反应较轻,均可耐受,无治疗相关死亡,主要表现为骨髓抑制、消化道反应及脱发。两组Ⅲ+Ⅳ度白细胞减少率的比较差异有统计学意义(P<0.05),其余Ⅲ+Ⅳ度毒副反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。表2 两组患者毒副反应比较
  2.4 两组患者的生存期
  实验组的中位生存期(MST)为11个月,对照组的中位生存期(MST)为7个月,两组生存期差异有统计学意义(χ2=4.36,P=0.032 8)。见图1。图1 两组患者生存率的比较
  3 讨论
  卵巢癌病变隐匿,具有早期扩散的生物学行为,且缺乏简便易行、特异的早期诊断方法,约70% 的患者确诊时已属中晚期( Ⅲ~Ⅳ期) [3],中晚期卵巢癌肿瘤细胞广泛播散转移、病灶巨大固定以及邻近组织的严重浸润,尽管卵巢癌的癌细胞对化疗非常敏感,但其病死率却居第一位[5],卵巢癌患者化疗后,其体内残留癌细胞的量对于患者的生存率至关重要[4]。CK19 是一种酸性蛋白质,为上皮细胞骨架的一部分。在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了CK降解,使得大量片段入血。正常造血组织、淋巴细胞中无CK19的表达,CK19在肿瘤的发生和转移中发挥重要作用,是循环癌细胞检测及早期癌症微转移的分子标志之一。故检测外周血中CK19-mRNA的表达,可推断有表达CK19的上皮细胞及肿瘤细胞的异位存在[6]。
  随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展,细胞介导的过继免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一,其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。DC-CIK 治疗已作为肿瘤过继免疫治疗的首选方案,陈斯泽、应敏刚等[7,8]报道应用CIK细胞与DC联合治疗145例晚期恶性实体瘤的近期疗效,结果显示82例可评价病灶的患者中,CR 3例,PR 7 例;31 例不可评价病灶的患者中,7例患者胸腹腔积液消失,与治疗前相比,治疗后患者外周血T 淋巴细胞中的CD3+和CD8+ 所占的比例明显升高。Li等[7]认为,DC-CIK 细胞联合化疗治疗非小细胞肺癌2年生存率较对照组提高约16%。
  本实验采用RT-PCR方法检测DC-CIK细胞联合化疗对中晚期卵巢癌患者外周血微转移灶CK19-mRNA表达的影响,发现较单纯化疗能显著降低CK19-mRNA的表达量。在治疗效果上,实验组化疗有效率、生存率均优于实验组,毒副反应亦较对照组轻,推测DC-CIK细胞可能通过清除外周血微转移灶CK19-mRNA表达量而起到化疗增效的作用,为恶性肿瘤的生物治疗提供科学理论与实验依据,具有重要的临床意义。
 
DC-CIK细胞治疗对晚期卵巢癌患者外周血CK19-mRNA表达的影响
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