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大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

期刊级别: 综合论文写作指导
【摘要】 目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法: 在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037~155 bp段长为1 292 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中, 构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。 海南医学院学报 2012,18(5),Journal of Hainan Medical University)  海南医学院学报 Vol.18 No.5 May.2012
【关键词】 启动子;大鼠;葡萄糖转运体3(GLUT3); 荧光素酶报告基因载体
  [ABSTRACT] Objective:To clone the rat GLUT3 promoter, construct and identify the firefly luciferase reporter gene vector pGL3-GLUT3. Methods:The promoter sequences of rat GLUT3 gene was obtained by PCR method. The product of PCR was inserted into pGL3- basic vector by T4 DNA ligase after double digestion with Kpn Ⅰand XhoⅠ. The constructed vector pGL3-GLUT3 was transferred into DH5a E. coli. The positive clone was identified by double digestion with Kpn Ⅰand Xho Ⅰand DNA sequencing. Finally, pGL3-GLUT3 was contransferred with pRL-TK into PC12 cells and primary culture neurons by lipofectamine 2000 to identify its promoter function. The control group was contransferred with pRL-TK and pGL3-basic. Results:The luciferase activity in primary culture neurons group was higher than that of control group(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008). The luciferase activity in PC12 cells group was 2.797 7±0.512 0,and that of its control was 1.179 8±0.312 5,P=0.010. Conclusions:A 1 292 bp rat GLUT3 promoter was successfully cloned and the firefly luciferase reporter gene vector pGL3-GLUT3 was well constructed. In PC12 cells and primary culture neurons, pGL3-GLUT3 has the promoter function.
  [KEY WORDS] Promoter;Rat; GLUT3 gene;; Luciferase reporter gene vector
  越来越多的研究表明,葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)是一个具有重要功能的蛋白,同时GLUT3的表达受到了多种因素的调控。为了进一步研究GLUT3基因的转录调控,本实验对大鼠GLUT3基因的启动子区进行克隆,构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并在PC12细胞和原代培养的神经细胞中验证了所构建载体具有启动子活性。现将实验过程与结果报道如下。
  1 材料与方法
  1.1 菌株、细胞株、质粒及实验动物
  大肠杆菌E coli DH5a、大鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12由中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心保存;pGL3-basic、pRL-TK购置Promega公司;新生SD乳鼠购自中山大学实验动物中心。
  1.2 主要试剂
  DMEM/F12培养基、阿糖胞苷、B27、DNase I、脂质体lipofectamine 2000购置Invitrogen公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;基因组DNA提取试剂盒购自上海申能博彩公司;预混PCR反应试剂盒,质粒小量提取试剂盒,DNA凝胶回收试剂盒,限制性内切酶KpnI、XhoI,T4 DNA连接酶,100 bp DNA Marker 等购置大连宝生物工程有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购置Promega公司;微管相关蛋白-2(MAP-2单克隆抗体,CY3标记的羊抗鼠IgG二抗购自武汉博士德公司。
  1.3 引物设计与合成
  根据Genebank中大鼠GLUT3基因(基因ID:25551)gDNA 序列,设计引物如下:上游引物5′Tac Ggtacc acatgctcagctgctgctccac 3′,其中划线部分为KpnI酶切位点;下游引物:5′Tag ctcgag taccgactgctggagctgatct 3′,其中划线部分为XhoI酶切位点。引物均由上海生工生物技术有限公司合成。
  1.4 大鼠脑组织基因组DNA的提取
  按照上海申能博彩公司基因组DNA提取试剂盒说明书进行。所得基因组DNA经紫外分光光度仪测定其纯度与质量。
  1.5 大鼠GLUT3启动子区序列克隆
  以大鼠基因组DNA 为模板,克隆出上下游引物间的启动子片段。PCR反应:50 μL体系,其中预混PCR反应液 25 μL,上游引物(10 μmol/L) 2.0 μL,下游引物 (10 μmol/L) 2.0 μL,模板(200 ng/μL)2.0 μL, ddH20 19 μL。反应条件:94℃预变性 4 min 94℃ 1 min; 60℃ 1 min; 72℃1 min 30 s,30个循环,最后72℃保温5 min。PCR扩增产物按大连宝生物工程有限公司DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收纯化。纯化产物经琼脂糖胶电泳与紫外分光光度计检测。
  1.6 大鼠GLUT3启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体构建
  “1.5步骤”中回收纯化的DNA 片段与pGL 3-GLUT3载体分别予以Kpn I、Xho I双酶切,纯化回收,连接,转化感受态细菌。转化后的DH5a涂于Amp抗性的LB培养皿上37℃培养。挑取生长菌落摇菌扩增,部分扩增菌液用作模板,用“1.5步骤”中上下游引物进行PCR反应,初步鉴定;部分均液用于提取质粒,对提取所得质粒行KpnI、XhoI双酶切鉴定;最后送上海生工生物技术有限公司测序鉴定。
  1.7 细胞培养处理
  PC12细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,37℃、5%CO2培养箱中培养,3~4 d传代一次。转染过程:以1×105/孔密度接种于24孔板,培养24 h时后(约达80%融合度)分成实验组与对照组,按照lipofectamine 2000说明书分别进行转染。实验组共转染pGL3-GLUT3与pRL-TK,对照组共转染pGL3-basic与pRL-TK,每组转染3孔。转染后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h,最后按照Promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行荧光素酶活性检测。
  1.8 大鼠原代神经元细胞培养与处理
  1.8.1 大鼠原代神经元细胞培养
  大鼠原代神经细胞培养主要步骤:培养前24 h,用0.1g/L的多聚赖氨酸溶液包被培养皿(板),使用前在超净台内用PBS冲洗2遍。取新生24 h内SD大鼠乳鼠, 脱颈处死后放入75% 酒精中消毒1 min, 取出脑组织, 置入超净台内冰面上内含预冷过PBS的培养皿中,分离出双侧大脑皮层,剔除脑膜和血管, 用冰浴的PBS清洗2 次, 剪碎, 加0.025%胰酶10mL。放入37 ℃、5 %CO2 培养箱中消化,消化期间每隔5 min摇匀消化液一次,20 min后用2 mL 含有15%胎牛血清的DMEM/F12终止胰酶反应, 同时加入2mg/L DNase I 0.1 mL,轻柔吹打, 用筛网过滤。滤液经100 0 r/min离心5 min,弃去上清,沉淀用含有B27、15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬,并以2 ×106/ 孔细胞数种植于包被过的6孔板。3 d后第一次半量换液,并加入终浓度为5 μg/mL的阿糖胞苷以抑制非神经元细胞生长。之后, 每隔3 d半量换液,培养至第9天时,部分细胞行MAP-2免疫荧光鉴定;其他细胞进行转染实验,后续实验步骤同PC12细胞处理。
  1.8.2 神经元免疫荧光染色鉴定
  神经元接种于预先包被有多聚赖氨酸的盖玻片上,生长良好后,按照常规免疫荧光操作步骤进行。简述如下:用PBS液冲洗细胞1遍,4%多聚甲醛固定15 min;PBS清洗5 min×3,加0.3%triton-100 作用15 min,1%过氧化氢溶液阻断15 min,PBS清洗5 min×3,山羊血清封闭液封闭50 min,吸除多余的血清,加入MAP-2单克隆抗体(1∶50 稀释), 阴性对照用PBS替代一抗, 4℃保湿孵育过夜, 滴加Cy3标记的羊抗鼠IgG二抗, 37℃避光保湿孵育60 min, 荧光显微镜观察、拍照,镜下出现红色荧光为阳性。
  1.9 荧光素酶活性检测
  按照Promega公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行,分别测定各组样本的荧光素酶活性。
  1.10 统计学处理
  结果采用SPSS 13.0软件进行独立样本t检验进行统计分析,P<0.05认定为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 大鼠DNA提取结果
  提取所得大鼠基因组DNA,经紫外分光光度仪检测,OD260/OD280=1.85。所得大鼠基因组DNA质量良好,适用于PCR反应模板。
  2.2 大鼠GLUT3启动子区PCR扩增结果
  PCR扩增反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后呈单一条带,大小1 000~2 000 bp,符合预期大小(图1a)。
  2.3 pGL 3-GLUT3质粒鉴定结果
  郑传宜等.大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定  pGL 3-GLUT3质粒经过KpnI、XhoI双酶切后可以出现一条大小在1 000~1 500 bp的片段,符合预期效果(图1b)。pGL 3-GLUT3质粒经送上海生工公司测序后证实插入片段序列与Genebank中大鼠GLUT3基因(gene ID:25551) 5′侧翼区序列一致。
  a: Lane1为1kb DNA marker, lane 2为大鼠GLUT3启动子片段PCR产物,大小1 000~2 000 bp;b:Lane 1为pGL3-GLUT3质粒经KpnI/XhoI双酶切后电泳图像,可见切下片段大小1 000~1 500 bp; Lane2为100bp DNA marker图1 相关电泳图片
  2.4 细胞培养与处理结果
  原代培养的神经细胞镜下观察见图2A~C。A: 未加阿糖胞苷处理的原代培养的细胞图像,可见神经元与神经胶质细胞;B:经过阿糖胞苷处理后的原代培养细胞,主要为神经元;C:神经元特异标志MAP-2免疫荧光染色图片,可见培养的细胞MAP-2表达阳性。图2 原代培养的神经细胞镜下观察
  2.5 荧光素酶活性检测结果
  在原代培养神经细胞中,瞬时共转染pGL3-GLUT3/pRL-TK组荧光素酶活性为5.182 9±0.264 8,转染pGL3-basic/pRL-TK组荧光素酶活性为2.893 1±0.775 4,两组相比差异有统计学意义(P=0.008);在PC12细胞中,瞬时共转染pGL3-GLUT3/pRL-TK组荧光素酶活性为2.797 7±0.512 0,转染pGL3-basic/pRL-TK组荧光素酶活性为1.179 8±0.312 5,两组相比差异亦有统计学意义(P=0.010)。
  3 讨论
  目前研究已经证实GLUT3与神经元保护、胚胎发育、肿瘤形成、精子运动功能等多种重要病理、生理过程有密切联系,是一个功能重要的蛋白体。GLUT3的表达也受到了多种因素的调控[1-3]。但是这些因素是如何调控GLUT3的表达目前尚不清楚。基因的表达调控可在转录、翻译、翻译后等多个水平上,但转录调控水平最为重要。基因启动子的研究是转录调控的一个重要内容,其中启动子的克隆又是基因启动子功能研究的基础。
  启动子克隆常用的方法有启动子探针载体筛选法、PCR克隆法、染色体步移技术克隆法、YADE法等[4]。随着生物信息学技术的不断发展,各种生物信息学软件对启动子预测的准确率逐步提高。在预测出结果之后,再设计相应的引物用PCR方法,就可较为容易地克隆出目的片段。这可以大大减少实验的盲目性,提高实验效率,已被越来越多的研究者所采用[5,6]。本研究前期已经对大鼠GLUT3基因的5′侧翼区调控序列进行了较为充分的分析,依据分析结果设计相应的引物,成功扩增出了一段长约1 292 bp的片段,经过测序后证实所克隆片段与Genebank中大鼠GLUT3基因的5′侧翼区序列一致。
  报告基因载体的构建是研究启动子功能的一种常用手段,检测报告基因的表达量,可以直接反映所克隆片段的启动子活性。常用的报告基因有胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光素酶基因等[7]。理想的报告基因须具备的条件有:表达产物容易检测,在被检测体系中背景表达小,检测灵敏度与特异性高,检测的线性相关性广。荧光素酶的检测则只需短短数秒,易于检测,哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶背景低,由萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成的双荧光素酶报告基因系统,可见测出1×10-19mol 的酶分子,具有超高的灵敏性与特异性,检测的线性范围可达6~8个数量级,所以荧光素酶是理想的报告基因[8,9]。尤其是在研究质粒转染效率低下的神经细胞,使用检测灵敏度更高的荧光素酶作为报告基因在相当大程度上可以弥补转染率低下对实验的影响。本研究在成功克隆了大鼠GLUT3基因启动子区序列后,已构建出了萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。
  为了能在细胞和分子水平对神经系统疾病的病理、生理机制进行研究,神经细胞的原代培养,建立合适的细胞模型是必要的。原代神经细胞的培养方法较多,而且在各个实验室也不尽相同[10-15]。大致不同点有:取材部位、取材时间、培养条件3个方面的不同,取材部位可以是脑组织也可以是背根神经节,脑组织常用的又有大脑皮层、小脑皮层与海马等;取材时间可以分为胚胎期与新生期;培养条件上的不同就更为广泛,大致在于血清浓度、培养基类型、抗DNA药物、添加剂等。各种方法都有其各自的优缺点,依据实验目的选用适合的方法。本实验选用新生24 h内的乳鼠作为取材源,选用DMEM/F12为基础培养基,同时加入含有15%胎牛血清与添加剂B27。在这种高营养培养条件下,神经细胞和非神经细胞均可较好地贴壁生长,又因神经元处于高分化细胞,没有细胞增殖能力,而非神经元细胞(主要为胶质细胞)则大量快速生长,并在神经元下方形成致密的细胞层,造成培养物透光性明显下降。因此,在培养液中加入抗代谢药物阿糖胞苷后,非神经元细胞明显受到抑制,而神经元生长则未受到明显的影响,培养物透光性明显优于未加阿糖胞苷组。在培养的原代神经细胞中神经细胞具有典型的突起,为进一步证实,实验用神经元特异标志MAP-2进行免疫荧光检测,其结果显示培养所得细胞MAP-2表达阳性。
  最后将pGL3-GLUT3用脂质体lipofectamine 2000瞬时转染PC12细胞和原代培养的神经元,测定各自的荧光素酶活性,结果显示不论在PC12细胞还是原代培养的神经元中,转染pGL3-GLUT3组的荧光素酶活性均比转染空载体pGL 3-basic的对照组升高,而且差异有统计学意义。
  综上所述,本实验成功构建出能在PC12与原代培养神经元中都具有启动子活性的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。
大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定
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