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金雀异黄素对Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞分泌白细

期刊级别: 综合论文写作指导

【摘要】   观察金雀异黄素(genistein, Gen)对Ⅱ型胶原诱导型关节炎(collageninduced arthritis, CIA)大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocyte, FLS)分泌炎症因子白细胞介素1β(interleukin1β, IL1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)的影响。方法:采用Ⅱ型胶原注射建立CIA动物模型,用关节炎指数(arthritis index, AI)分析法评估CIA模型是否建立成功。胶原酶消化法分离培养原代FLS,用流式法检测滑膜细胞血管细胞黏附分子1(vascular cell adhension molecule1, VCAM1)的表达。在FLS培养液中加入不同浓度的Gen,用酶联免疫吸附测定法检测FLS培养上清中IL1β和TNFα的含量。 结果:Ⅱ型胶原致敏后3 d,大鼠开始出现关节肿胀,AI逐渐增高,至造模后第3周最为明显,与空白对照组比较差异有统计学意义。大鼠滑膜细胞培养至第4代,检测其VCAM1的表达高达85.5%,提示所培养的细胞为FLS,即B型滑膜细胞。不同浓度的Gen(100、200、400 μmol/L)作用于FLS细胞后,细胞培养上清中TNFα和IL1β的分泌不同程度地受到抑制,且抑制作用呈剂量依赖性。结论:金雀异黄素能抑制FLS分泌TNFα和IL1β,且抑制作用呈剂量依赖性,这可能是其抗CIA大鼠滑膜炎的作用机制之一。

【关键词】 关节炎 金雀异黄素 成纤维样滑膜细胞 白细胞介素1β 肿瘤坏死因子 α 大鼠

  Effects of genistein on interleukin1β and tumor necrosis factorα secreted by fibroblastlike synoviocytes isolated from type Ⅱ

  collageninduced arthritis rats

  Bo GAO, Yu ZHANG, Li MA, Xuezeng ZHANG

  Department of Hematopathy and Rheumatism, Clinical Medicine College, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

  Objective: To investigate the effects of genistein (Gen) on interleukin1β (IL1β) and tumor necrosis factorα (TNFα) secreted by fibroblastlike synoviocytes (FLSs) of rats with type Ⅱ collageninduced arthritis (CIA). Methods: Type Ⅱ collagen was injected to induce arthritis in rats, and arthritis index was applied to evaluate whether the arthritis was induced successfully. The primary FLSs were separated from synovial membranes by using type Ⅱ collagenase digestion. Then the expression of vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) was estimated by flow cytometry (FCM). After addition of different concentrations of Gen into the FLSs, IL1β and TNFα contents in the supernatants were measured by enzymelinked immunosorbent assay.Results: Three days after collagen injection, the rats started to develop arthrocele and the arthritis index increased gradually. The arthritis index of CIA group was significantly higher than that of the control group. The expression of VCAM1 was up to 85.5% in the 4th generation FLSs, indicating that most part of the cultured cells were typeB synoviocytes. After administration of different concentrations of Gen (100, 200, 400 μmol/L), the contents of IL1β and TNFα in supernatants of FLSs were decreased dosedependently.  Conclusion: Genistein can suppress the secretion of TNFα and IL1β in FLSs dosedependently, which may be one of the mechanisms for genistein in inhibiting the arthromeningitis of CIA rats.

  Keywords: arthritis; genistein; synoviocyte; interleukin1β; tumor necrosis factorα; rats

  类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性多关节滑膜炎为主要临床表现的自身免疫性疾病。病理特征主要表现为滑膜细胞(主要为成纤维样细胞)异常增殖和炎症细胞浸润,形成侵袭性血管翳,侵蚀软骨与骨导致关节破坏。RA患者滑液中滑膜细胞明显增多,其中含有大量成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocyte, FLS),FLS的堆积与其凋亡减少有关[1]。增生的FLS周围还有大量炎性细胞浸润,不仅可导致基质降解,还可产生大量炎症因子如白细胞介素1(interleukin1, IL1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)等[2],从而导致滑膜炎症和软骨及骨的破坏。金雀异黄素(genistein, Gen),又叫染料木素,5,7,4三羟异黄酮,是大豆中异黄酮的主要成分。流行病学调查和实验室研究资料表明其具有抗肿瘤、防辐射、抗衰老、神经保护、预防神经退行性疾病和妇女骨质疏松、调节血脂、降低血中胆固醇以及预防和治疗动脉粥样硬化等作用[3]。近年来的研究发现,Gen的生物学作用机制可能与抑制RA的发病有密切关联[4]。本实验通过建立胶原诱导型关节炎(collageninduced arthritis, CIA)大鼠模型,取关节滑膜分离原代FLS培养,观察Gen对FLS分泌TNFα及白细胞介素1β(interleukin1β, IL1β)的影响。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  1.1.1 实验动物 雌性近交系SD大鼠,清洁级,4~6周龄,体质量为(180±20)g,购于南京医科大学实验动物中心,合格证号为SLK(苏)20020031。

  1.1.2 药物和试剂 Ⅱ型胶原(批号为SL08325)、Gen和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),购自美国Sigma公司;卡介苗(Bacille CalmetteGuerin, BCG),购自兰州生物制品研究所;藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的小鼠抗大鼠血管细胞黏附分子1(vascular cell adhension molecule1, VCAM1)抗体、小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)同型对照品,购自Biolegend公司;兔抗大鼠IL1β、兔抗大鼠TNFα,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗兔IgG抗体,购自武汉博士德生物工程有限公司;四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)显色试剂盒,购自北京博奥森生物技术有限公司;达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM),购自上海生物工程有限公司;小牛血清,购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

  1.1.3 仪器 CO2培养箱(23232型),购自美国Sheldon公司;倒置显微镜(XDS1型),购自重庆光学仪器厂;超净工作台(CA14802型),购自上海上净净化设备有限公司;高压锅(YXQSG41280型),购自上海华线医用核子仪器有限公司;离心机(5804R型),购自德国Eppendorf公司;酶标仪MK3(ELX800型),购自美国BIOTEK公司。

  1.2 实验方法

  1.2.1 CIA大鼠模型的建立 模型制备参照文献方法[5]。Ⅱ型胶原5 mg溶于预先配制的浓度为0.1 mol/L的1 mL乙酸溶液中,使Ⅱ型胶原浓度为5 mg/mL,4 ℃过夜,充分溶解;然后与已配制的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)等体积于冰浴中混合,用注射器反复抽吸,使之充分乳化。取10只SD大鼠,随机取出5只大鼠作为空白对照组,于每只大鼠左后足跖皮下注射0.1 mL生理盐水;其余5只大鼠分别于左后足跖皮下注射0.1 mL浓度为2.5 mg/mL的Ⅱ型胶原致敏1次。第21天用乳化后的Ⅱ型胶原以0.1 mL/只的剂量尾根部皮内多点激发注射1次。

  1.2.2 CIA大鼠模型的评价 致敏后,参照文献方法[6],每天观察左右后足和左右前足的关节炎症程度。每周评价大鼠关节炎指数(0分:无关节炎;1分:有红色斑点或轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:严重肿胀;4分:严重肿胀且不能负重),每只大鼠四肢最高总分为16分。

  1.2.3 成纤维样滑膜细胞的分离和培养 成纤维样滑膜细胞的分离和培养参照文献方法[7]。造模第6周,将大鼠处死,在膝关节腔中分离出滑膜组织,浸泡于含有800 U/mL青霉素、链霉素的1×磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)中。将组织分离剪碎成1 mm3左右的小块,加入约2 mL 4 mg/mL Ⅱ型胶原酶,置于37 ℃ CO2培养箱内消化2 h(期间每隔15 min吹打一次)。将未贴壁细胞移入离心管内,1 000 r/min离心(离心半径10 cm),加入4 mL 0.25%胰酶0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)置于37 ℃ CO2培养箱中消化20 min(期间10 min吹打一次)。筛网过滤,用不含青霉素、链霉素的PBS液洗网,加入含20%小牛血清的DMEM培养液3~4 mL,混悬细胞,移至25 cm2培养瓶内培养。24 h后及时观察,吸弃仍未贴壁的细胞,更换培养液,继续培养。以后每天显微镜下观察细胞生长,3 d换液一次。待滑膜细胞长至80%左右,0.25%胰酶0.02% EDTA消化,用台盼蓝染色检测其活力。用细胞计数板计数,调整所需滑膜细胞悬液的细胞浓度。

  1.2.4 成纤维样滑膜细胞的鉴定 取第2~6代滑膜细胞,0.25%胰酶0.02% EDTA消化后,将细胞分别重悬于100 μL的PBS中。分别予PE标记的小鼠抗大鼠VCAM1抗体及对应的同型对照IgG(阴性对照),4 ℃避光条件下孵育30 min,洗涤细胞。流式细胞仪激发光为488 nm氩离子,PE滤光片波长为575 nm,检测滑膜细胞VCAM1的表达。

  1.2.5 成纤维样滑膜细胞的处理 取培养至第4代的原代成纤维样滑膜细胞,分别制备含有不同药物浓度的细胞悬液,接种于24孔板中,使细胞悬液中Gen的终浓度分别为100、200、400 μmol/L,阳性对照甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)的浓度为1 mg/L,各组脂多糖的浓度为5 mg/L。72 h后收集细胞上清,-20 ℃冰箱保存待测。具体分组如下:(1)正常大鼠成纤维样滑膜细胞组;(2)CIA大鼠成纤维样滑膜细胞,不加药组;(3)CIA大鼠成纤维样滑膜细胞+MTX(1 mg/L);(4)CIA大鼠成纤维样滑膜细胞+Gen1(100 μmol/L);(5)CIA大鼠成纤维样滑膜细胞+Gen2(200 μmol/L);(6)CIA大鼠成纤维样滑膜细胞+Gen3(400 μmol/L)。

  1.2.6 ELISA法测定成纤维样滑膜细胞培养上清液中IL1β和TNFα的浓度 方阵滴定实验确定抗原包被浓度,抗体稀释度和作用时间,二抗稀释度和作用时间等反应参数[8]。用包被缓冲液将抗原(细胞上清)稀释,每孔加抗原100 μL,4 ℃过夜(18~24 h)。次日,各孔分别加3% ELISA封闭液100 μL,置37 ℃ 1 h。按1︰500(洗涤缓冲液)稀释一抗(兔抗大鼠IL1β、TNFα抗体)加入反应孔,空白对照组(不加抗体)加100 μL洗涤缓冲液,4 ℃过夜。次日,各反应孔中加入新鲜稀释的1︰2 000酶标抗体(HRP标记的羊抗兔IgG抗体)100 μL,置37 ℃孵育1~2 h。保温完毕后洗涤。于各反应孔中加入TMB试剂盒中的底物溶液A液和B液各50 μL,避光显色20 min。于各反应孔中加入C液(2 mol/L硫酸)50 μL,终止酶促反应。用酶标仪在490 nm波长下比色测定各孔光密度(optical density, OD)值,反应孔与空白孔的差值为最终的光密度值,每组6个复孔。

  1.3 数据处理及统计 采用微软Excel 2003和SPSS 11.0医学统计软件进行统计学处理。两组间比较用t检验,两组以上样本的均数比较用单因素方差分析,用NewmanKeuls法处理组间均数的两两比较,检验水准α=0.05。

  2 结 果

  2.1 大鼠一般情况的观察 模型组大鼠注射胶原乳剂后,饮食和活动减少,后期可见毛发干枯无光泽,关节活动障碍,而空白对照组大鼠无以上表现;模型组大鼠造模侧足趾皮肤破溃,3 d后出现足踝、足趾及膝关节红肿,于第7~10天开始红肿加重,关节表面皮肤发亮充血,并逐步向对侧及双前肢蔓延。在第21天加强免疫后上述症状持续存在。空白对照组大鼠无关节肿胀、皮肤破溃及关节活动障碍等表现。模型组的关节炎指数评分与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。 表1 CIA大鼠关节炎指数评分

  2.2 滑膜细胞的观察 胶原酶消化法培养滑膜细胞,滑膜细胞分离培养24 h后开始贴壁,可见许多细胞呈梭形树突状生长,有少量呈圆形生长,胞质突起细长或较短,具有成纤维样细胞的特性。经台盼蓝染色活细胞率大于90%。待细胞长至密度为80%左右,用胰酶消化法进行细胞传代培养。传代后的细胞增殖活跃,有明显的核分裂相。细胞可呈集落性生长,长满后呈极向排列。见图1。

  2.3 成纤维样滑膜细胞VCAM1的表达 待细胞培养至2周时,胰酶消化法分散细胞,细胞计数,制备细胞悬液浓度为1×106/mL,检测滑膜细胞VCAM1的表达。第2~6代的滑膜细胞检测后发现,第4代的CIA大鼠滑膜细胞PE标记VCAM1的表达为85.5%,表明细胞悬液中绝大部分为成纤维样滑膜细胞,即B型滑膜细胞。图2显示所检测的细胞绝大部分为同一类型的细胞(即FLS),下方显示成纤维样滑膜细胞VCAM1的表达高于同型阴性对照。

  2.4 金雀异黄素对成纤维样滑膜细胞分泌的炎症因子IL1β和TNFα的影响 LPS诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞上清中IL1β、TNFα的分泌量明显高于正常大鼠成纤维样滑膜细胞。MTX(1 mg/L)可抑制LPS诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞上清中IL1β、TNFα的高分泌。Gen(100、200、400 μmol/L)可抑制CIA大鼠滑膜细胞IL1β、TNFα的分泌,且随着药物浓度从100 μmol/L增加到400 μmol/L,抑制作用明显增强。100 μmol/L的Gen对IL1β、TNFα表达的抑制作用弱于MTX,而400 μmol/L Gen要强于MTX。见表2。  表2 金雀异黄素对LPS诱导的FLS细胞上清中分泌TNFα和IL1β的影响

  3 讨 论

  胶原诱导型关节炎是兼有体液免疫和细胞免疫变化的慢性系统性免疫性炎症,因CIA模型的遗传背景和免疫病理学改变与临床RA极为相似而成为目前研究RA较为理想的动物模型。本实验采用此方法建立的RA模型,造模组大鼠出现明显的关节肿胀伴活动障碍,关节炎指数评分与正常组有明显的差别,提示CIA模型建立成功,为下一步原代滑膜细胞的培养打下了基础。

  正常滑膜衬里层细胞分为A型细胞(巨噬细胞样滑膜细胞)、B型细胞(成纤维样滑膜细胞),分别具有巨噬细胞样和成纤维细胞样的形态特征[9]。VCAM1在正常的滑膜组织衬里层的成纤维样滑膜细胞持续表达,是与滑膜下层成纤维细胞及皮肤成纤维细胞区分的特异性标记。故VCAM1是目前常用的鉴别成纤维样滑膜细胞的一种特异性的标记物[10]。我们用流式法检测培养的滑膜细胞表面VCAM1的表达发现,VCAM1的表达在第1代约20%,第2代约50%左右,培养至第3代约为70%,第4代细胞VCAM1的表达为85.5%,第4代的滑膜细胞中大部分为成纤维样滑膜细胞。由于A型滑膜细胞存活时间较短,一般在培养10 d以后就开始老化,并逐步死亡,所以2周以上的滑膜细胞以成纤维样滑膜细胞为主。我们取第4代滑膜细胞用于实验,一方面避免A型滑膜细胞的存在影响实验结果,另一方面也防止了成纤维样滑膜细胞因为传代过多而引起细胞的老化。

  RA的基本病理改变为滑膜慢性炎症和侵袭性血管翳的形成。在RA中,滑膜细胞异常增殖及炎症细胞浸润,同时分泌TNFα、IL1β及一些其他的致炎症因子参与炎症过程,细胞因子是导致RA病人滑膜炎症的重要因素。在RA中,IL1、IL6、IL8、IL12、IL17、TNFα、IFNγ等都参与了关节炎症的发生发展过程,其中TNFα和IL1β是参与RA发病的主要的细胞因子[11]。Youn等[12]检测到RA患者血清和关节液中TNFα的含量明显高于骨关节炎(osteoarthritis, OA)的患者以及正常人。在IL1受体拮抗物基因缺陷的啮齿类动物,关节破坏发生明显增多[13]。在目前临床风湿性疾病的治疗中,IL1已经作为第二个抗炎治疗的靶目标,而且已有临床证据证实IL1拮抗剂治疗RA是有效的[14]。本研究证实LPS诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞培养上清中TNFα、IL1β的表达要明显高于正常成纤维样滑膜细胞,进一步证实了TNFα、IL1β在RA滑膜炎症的发病机制中起着重要的作用。

  金雀异黄素是大豆异黄酮的主要活性成分,有着广泛的抗肿瘤活性,已成为抗肿瘤研究的热点。许多研究提示Gen能影响炎症过程:(1)在鼠的主动脉移植模型中,Gen能抑制移植物血管中炎症细胞的浸润,减少细胞因子的生成[15];(2)Gen能减少LPS诱导的肝脏IL1β、IL6等炎症因子的释放,且其减少程度呈剂量依赖性[16];(3)Gen能抑制前列腺癌NFκB途径的激活[17]。我们的研究结果证实,Gen可明显抑制CIA大鼠成纤维样滑膜细胞培养上清中TNFα和IL1β的分泌,且抑制作用呈剂量依赖性增强。200 μmol/L Gen对CIA大鼠关节滑膜中FLS分泌TNFα和IL1β的抑制作用与MTX相似,100 μmol/L的Gen对IL1β、TNFα表达的抑制作用弱于MTX,而400 μmol/L的Gen要强于MTX,治疗剂量的MTX也能抑制FLS分泌TNFα和IL1β。提示Gen有可能通过抑制FLS分泌TNFα和IL1β而达到抗RA关节炎症的作用。

  总之,一定浓度的Gen能下调CIA大鼠FLS分泌的TNFα和IL1β水平,且其抑制作用呈浓度依赖性增强,而Gen具体是通过何种机制影响TNFα和IL1β的生成,Gen是否能应用于临床治疗RA,尚需进一步研究。

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